【產品簡介】

鬼筆環肽（Phalloidin），又稱鬼筆鵝膏素，最初是從毒蘑菇鬼筆鵝膏菌(Amanitaphalloides)中分離到的一種雙環肽，可以極高的親和力和特異性與肌動蛋白絲 F-actin 結合，不會結合單體肌動蛋白（G-actin）。鬼筆環肽對大小纖維的親和力相近，在許多不同的動植物物種的肌肉和非肌肉細胞中，基本都按照一個肌動蛋白亞基與一個鬼筆環肽分子的化學計量比結合。不像肌動蛋白抗體，對不同物種或來源的機動蛋白親和力會發生明顯變化。鬼筆環肽的非特異性結合幾乎可以忽略，染色和未染色區域的差異非常明顯。鬼筆環肽及其衍生物在納摩爾濃度即可對 F-actin 染色，可以非常方便的標記、識別和定量研究 F-actin 的分布。

本產品為熒光染料 TRITC 標記的鬼筆環肽，以 20 μM 儲存液形式提供，溶劑為甲醇。常用濃度范圍 80-200nM，每次染色使用 200 μL 工作液即可。

【儲存與運輸】

冰袋（wet ice）運輸，-20℃避光保存；有效期 12 個月。

【使用方法】

試劑準備：自備 1×PBS 緩沖液（pH 7.2-7.4），固定液（貨號：HK2003），細胞通透劑（貨號：HKI0048），抗熒光淬滅封片劑（貨號：HKI0007），即用型 DAPI 染色液（貨號：HKI0005）等。

工作液配制：用 1×PBS 將本產品稀釋到需要的工作濃度，常用工作濃度為 80-200 nM。推薦使用 100nM，即每 1 μL TRITC 標記鬼筆環肽與 199 μL PBS 混勻。最佳染色工作濃度請參考文獻或進行預實驗摸索。鬼筆環肽染色工作液，現配現用，室溫避光保存。

操作步驟

1. 培養好的細胞爬片（密度至少達到半匯合），去除培養液，用 37℃預熱的 1×PBS 緩

沖液清洗細胞清洗細胞 2 次。

2. 加入含 4%甲醛的固定液覆蓋細胞，室溫固定 10 min。注意，甲醇能破壞肌動蛋白，因此固定液中不得含有甲醇，避免使用含甲醇的甲醛溶液。

3. 用 1×PBS 緩沖液清洗細胞 2-3 次，每次 30 s-1 min。

4. 用細胞通透劑覆蓋細胞，室溫透化細胞 5-10 min。

5. 用 1×PBS 緩沖液清洗細胞 2-3 次，每次 30 s-1 min。

6. 細胞爬片稍微甩干后，用組化筆畫圈使細胞位于圈中央。取 200 μL 現配的 TRITC 標記鬼筆環肽染色工作液完全覆蓋細胞，室溫避光孵育 30 min。注意，通常情況下，4-37℃均適合染色。為避免染色工作液揮發導致干片，孵育過程需將細胞爬片置于密封容器內，例如避光濕盒。

7. 用 1×PBS 緩沖液清洗細胞 2-3 次，每次 30 s-1 min。

8. （可選做）向爬片上滴加即用型 DAPI 染色液覆蓋細胞，進行細胞核染色 3-5 min。用1×PBS 緩沖液清洗細胞 2-3 次，每次 30 s-1 min

9. 細胞爬片稍甩干后，倒置在滴加一滴抗熒光淬滅封片劑的載玻片上，用紙巾吸掉對于封片劑。

【可選步驟】：完成步驟 7 后，直接將蓋玻片倒置在滴加含 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑（貨號：HKI0007-2）的載玻片上，然后吸掉多余的封片劑。以熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察結果。

10. 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察結果，選擇 TRITC（Ex/Em=546/575 nm）和 DAPI（Ex/Em=364/454nm）通道。

【注意事項】

1. 熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快完成檢測及觀察拍照。

2. 甲醇可以破壞 actin 蛋白，因此樣本前期固定不能使用含有甲醇的固定液。

3. 鬼筆環肽通常不具有細胞通透性，極少用于活細胞染色。

4. 本產品溶劑為甲醇，極易揮發，每次用完以后需及時擰緊管蓋密封保存。

5. 操作時請穿實驗服，并佩戴一次性手套。